| 常规问题：
问：双光子显微镜实验室的职责是什么？ 答：双光子显微镜实验室是为神经所各个课题组提供高级光学技术支持的公共实验室，其功能是为实验者提供光学显微镜实验服务。我们的职责是： 1． 掌握荧光显微镜领域最新的技术。
2． 维持设备的正常运行。
3． 培训新的学员正确使用仪器。
4． 协助有经验的实验者使用设备的更先进功能。 --------------------------------------------------------------------- 问：双光子显微镜实验室具有哪些仪器？ 答：
1． 蔡司 LSM510 Axiovert 200M 倒置单光子激光扫描共聚焦显微镜
蔡司 LSM510 Axiovert 200M 倒置单光子激光扫描共聚焦显微镜配有三个激光器：氩离子蓝光激光器( 458 / 477 / 488 / 514nm , 30mW )，氦-氖绿光激光器( 543nm , 1mW )，氦-氖红光激光器( 633nm , 5mW )。单光子显微镜具有四个PMT，其中三个用于荧光信号采集，一个用于透射光信号采集。
配备可选的物镜：
Plan-NeoFluar 5X/0.15, D=0.17 mm, Ph1, WD=13.6 mm
Plan-NeoFluar 10X/0.30, D=0.17 mm, DICI, WD=5.6 mm;
Plan-NeoFluar 20X/0.50, D=0.17 mm, DICII, WD=2.0 mm;
Plan-NeoFluar 40X/1.30 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.2 mm;
Plan-NeoFluar 40X/1.30 OIL, D=0.17 mm, Ph3, WD=0.2 mm
Plan-Apochromat 63X/1.4 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.19 mm
Alpha Plan-Fluar 100X/1.45 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.11 mm
C-Apochromat 63X/1.20 W CORR, D=0.14 to 0.18 mm, DICIII, WD=0.24 mm;
2． 蔡司 LSM510 Axioskop 2FS 双光子正置激光扫描共聚焦显微镜
蔡司双光子正置激光扫描共聚焦显微镜配有三个可见光激光器和一个红外双光子激光器： 氩离子蓝光激光器（458/477/488/514nm, 30mW），氦-氖绿光激光器（543nm, 1mW）, 氦-氖红光激光器（633nm, 5mW），Mira-900 双光子激光器（700 – 980 nm, 500 mW）。 其中 Mira 900 双光子激光器包括一个 Verdi-V5 二极泵源固体激光器和一个 Mira-900-F 钛：兰宝石锁模激光器（配备一套Mira-F-V5-XW-110滤片）。Verdi-V5 是一个高能量二极泵源固体激光器，在 532nm 波段能产生高达5W 的持续能量。 Mira-900 是一个再生式钛：兰宝石锁模激光器，可产生波宽为 100飞秒的脉冲激光。这两个设备的联合可以产生 700-980nm 波长可调的红外脉冲激光束，用于双光子激发实验。 这套系统还装备了两个荧光通道的检测器（光电倍增管），一个 META 检测器，一个 NDD 检测器，一个透射光检测器。
配备可选的物镜：
Plan-Neofluar 10x/0.30, DICI
Plan-Neofluar 40xOil/1.3 DICIII
Plan-APO 20x/0.75 DICII
Plan-APO 20x/0.60 Ph2
Plan-APO 100xOil/1.4 DICIII
Achroplan 10X/0.30 W Ph1, WD=3.1 mm;
Achroplan 20X/0.50 W Ph2, WD=1.97 mm;
Achroplan 40X/0.80 W IR DICIII, WD=3.61 mm;
Achroplan 63X/0.90 W IR DICIII, WD=2.0 mm;
3．电生理实验设备
单光子共聚焦显微镜和双光子显微镜上还配置了若干用于电生理实验的设备，包括：EPC-10 膜片钳放大器，八通道程控脉冲发生器（A.M.P.I. 公司）, 光隔离的 ISO-Flex 刺激隔离器（A.M.P.I. 公司）, MP-285R 电动显微操纵器（Sutter公司），红外 CCD（C2400-79H ，Hamamatsu 公司）和控制部件（C2400-60，Hamamatsu公司），JVC 单色视频监视器（TM-H140PN ，JVC)。 --------------------------------------------------------------------- 问：哪些人能使用双光子显微镜实验室的仪器？ 答：我们主要对中科院神经所和上海生命科学院的教员、博士后、研究生、职工开放。也对附近大学与生物技术公司的人员实行限时开放。 --------------------------------------------------------------------- 问：我该怎么预约实验时间？
答：你可以和我们的工作人员联系预约实验。地点在中科院神经所 419 房间，电话是 021-54921820。 --------------------------------------------------------------------- 问：我如何取消自己的预约？
答： 必须提前一天取消所预约的实验 ，请致电 021-54921820 取消实验。 --------------------------------------------------------------------- 问：我该如何参加培训课？
答：由于仪器设备的复杂性，我们所有的培训都采用一对一的方式。需要参加培训的实验者请与神经所大楼 419 号房间的胡谦老师联系，或者电话预约（021-54921820）。我们建议实验者首先建立一个针对自己实验标本的有效的染色方法，在此基础上请自带一个荧光标记标本参加培训。 问：培训课上，我应该带些什么？
答：需要带一个荧光标记完好的标本。这意味着在培训课之前，你必须建立好你的染色方法和预先观察你的标本。请确认标本的信号足够强（很容易看到）、背景足够黑。我们的共聚焦显微镜系统是建立在蔡司的倒置显微镜和正置显微镜上，所以标本必须是如下：
- 标本在载玻片上固定好并且必须用盖玻片封片。而且，盖玻片的型号只能用 1 号或者 1.5 号。
- 使用单层盖玻片封底的槽或者培养皿。
--------------------------------------------------------------------- 激光扫描共聚焦显微镜实验方法
问：什么是激光扫描共聚焦显微镜实验方法？ 答：在传统的荧光显微镜中，一定波长的激发光被分光镜反射、通过物镜照亮标本，标本发出的荧光通过物镜被分光镜反射至目镜，被眼睛看到。 使用传统的荧光显微镜观察厚标本的主要问题是：侧向干扰（同一平面发出的荧光）和轴向干扰（不同平面发出的荧光）。 激光扫描共聚焦显微镜通过两种方式分别排除了传统荧光显微镜观察厚标本时发生的侧向干扰和轴向干扰：1）用一个聚焦的光束点扫描标本，由于单一时间标本上只有一个点被激发光照射，因此排除了侧向干扰； 2）在光检测器前设置一个可以改变大小的针孔，使标本焦平面以外的发射光不能到达检测器，因此排除了轴向干扰。
问：激光共聚焦显微镜比传统的荧光显微镜更容易漂白标本吗？ 答：荧光标记标本的漂白是荧光显微镜的一个主要问题。与传统的荧光显微镜将标本处于低能量和宽光束的激发光中相比，激光扫描共聚焦显微镜由于使用高能量和聚焦的光束，所以会增加标本的漂白。但是使用激光扫描共聚焦显微镜在采集图像时，每次只照射标本上一个微小的区域， 并且照射时间很短，所以又减少了标本的漂白。 --------------------------------------------------------------------- 问：蔡司倒置和正置显微镜的不同物镜的数值孔径是什么？ 答：
蔡司倒置和正置显微镜有15种不同的物镜：
Plan-NeoFluar 5X/0.15, D=0.17 mm, Ph1, WD=13.6 mm
Plan-NeoFluar 10X/0.30, D=0.17 mm, DICI, WD=5.6 mm;
Plan-NeoFluar 20X/0.50, D=0.17 mm, DICII, WD=2.0 mm;
Plan-NeoFluar 40X/1.30 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.2 mm;
Plan-NeoFluar 40X/1.30 OIL, D=0.17 mm, Ph3, WD=0.2 mm
Plan-Apochromat 63X/1.4 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.19 mm
Plan-APO 20x/0.75 DICII
Plan-APO 20x/0.60 Ph2
Plan-APO 100xOil/1.4 DICIII
Alpha Plan-Fluar 100X/1.45 OIL, D=0.17 mm, DICIII, WD=0.11 mm
C-Apochromat 63X/1.20 W CORR, D=0.14 to 0.18 mm, DICIII, WD=0.24 mm;
Achroplan 10X/0.30 W Ph1, WD=3.1 mm;
Achroplan 20X/0.50 W Ph2, WD=1.97 mm;
Achroplan 40X/0.80 W IR DICIII, WD=3.61 mm;
Achroplan 63X/0.90 W IR DICIII, WD=2.0 mm;
--------------------------------------------------------------------- 问：当我通过目镜观察时很难找到自己的标本时，有特别的技巧使我能更容易的找到标本吗？ 答：请核对以下几点： 确定分光器被选择在目镜的位置上，并有光照射在标本上。 如果使用的是汞灯，确定你选择了正确的荧光滤片。 确定标本的方向放置正确， 盖玻片应该朝向物镜。 如果你使用的是油镜，确定在物镜和盖玻片之间有足够的油，并且没有气泡。 一边移动平台一边观察，因为眼睛更容易看到移动的物体。 如果你仍然看不到任何东西，很有可能就是你的标本没有着色，你来双光子实验室之前应该首先用自己实验室的荧光显微镜观察自己的标本。 也有一个可能就是汞灯的位置不正。这时不要尝试自己去维修汞灯，而是请我们的工作人员去调节汞灯的位置。我们会确定是否只有这个问题，或者能找到别的原因使你找到标本。 --------------------------------------------------------------------- 问：为什么我的标本聚不上焦？ 答：显微镜的高倍镜都有高的数值孔径（达到1.4）和很短的工作距离（100–200 微米），所以标本必须靠近物镜。最常见的问题如下： 1． 盖玻片厚度不合适，高倍镜无法“穿透”盖玻片到达标本。
改进 – 使用 #1 或者 #1.5 盖玻片。 2．细胞种在载玻片上，使用封片剂封好，然后盖上盖玻片。如果使用了过多的封片剂，造成标本过厚，也可能使物镜无法聚焦到标本。 改进 - 用较少的封片剂，或者把细胞种在盖玻片上，然后固定在载玻片上。 3．如果细胞种在有垫圈的槽里，而在固定标本的时候垫圈未去掉，也会使得物镜离标本太远。 改进 – 把垫圈去掉或者将细胞直接种在有盖玻片底（取代载玻片底）的槽里。 --------------------------------------------------------------------- 双光子荧光显微镜方法
问：什么是双光子显微镜技术？
答： 双光子显微镜技术是建立在双光子激发效应的基础上的一种荧光激发技术：荧光染料分子可以同时吸收低能量的两个光子而被激发（两个光子到达荧光分子的时间间隔小于 1 飞秒），其激发效果可以等同于吸收一个 1/2 波长的高能量光子。 双光子的激发需要很高的光子密度。随着离焦平面的距离越远，光子密度程非线性迅速下，双光子激发也几率大大下降，因此只有近焦平面的染料分子才被激发，焦平面以外的组织不易发生光漂白和光毒性。虽然双光子激光器发出的激光具有很高的峰值能量，但平均能量很低，只有十分之几毫瓦，不足以引起标本的过热。 另外一种回答是： 传统的荧光显微镜的缺点是焦平面以外的信息也能被采集， 难以给细胞或组织内的蛋白精确地定位。 目前的解决办法是使用激光扫描共聚焦显微镜或者宽场去卷积技术来获得焦平面的信息。 在这些系统给一些科研提供解决办法的同时，还有两个问题需要克服。一个就是生物体组织对光是高度散射的，厚标本的信息很难采集。另一个是荧光分子的激发一般对细胞都有毒性，一般在时间序列图像采集的时侯，细胞的活性只能维持数分钟。 目前克服这些问题的技术是利用红外超短脉冲激光器产生激光来双光子激发标本。 激发同样的荧光分子，双光子的波长大约是单光子激发所需波长的两倍。长波长的光子不易被细胞吸收，因此对活细胞的光毒性减少，也降低了光漂白。另外长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，能够用来观察更厚的标本。 --------------------------------------------------------------------- 问：双光子激发的优点是什么？ 答：
1．增加了染料的选择性：共聚焦系统的激光器（Ar, Ar/Kr, HeNe）的激发光范围在 488nm - 647nm 。这就意味着想用紫外激发荧光染料的实验进行，例如使用 DAPI , Hoescht 。而双光子的激发波长是单光子的两倍，所以紫外激发的染料能被近红外光激发。
2．减少光漂白：因为光漂白减少的减少使得用 CFP/YFP 做荧光共振能量转移( FRET )的实验的成功率提高。 3．无需特殊的物镜：从硬件的角度出发，用近红外光的波长激发紫外激发染料不需要特殊的紫外光学组件。 4．提高信噪比：激发光波长和发射光波长具有很大的差别，提高了信噪比。 5．漂白局限于焦点处：因为荧光激发只发生在物镜的焦点上，所以就不需要共聚焦针孔了。这样提高了光的检测，而且光漂白只发生在焦点上。 6．更容易穿透标本：红外波长的光不易被细胞散射，能穿透更深的标本。 --------------------------------------------------------------------- 问：双光子显微镜方法和激光扫描共聚焦显微镜方法有何不同？ 答：双光子显微镜方法从很大程度上减少了普通的共聚焦显微镜方法存在的问题： 1．激光能引起荧光物质的光漂白。 因为共聚焦显微镜的针孔阻挡了组织发射的大部分的光，其中包括一些来自焦平面的光。所以为了获得足够的信噪比，需要很强的激发光。而强激光连续的扫描，导致了荧光染料的漂白。因此在做断层扫描或者时间序列扫描时，荧光信号逐渐变弱。 2．光毒性也是一个问题。荧光染料分子的激发会产生毒性自由基，如果实验者想保持标本活的状态，必须限制扫描的时间和激光的强度。 3．短波长的光被细胞成分散射不易穿透标本。 --------------------------------------------------------------------- 普通显微镜方法
问：我怎样固定一个用于显微镜观察的厚标本并且不损坏它？ 答：你需要将盖玻片垫高，至少要达到标本/细胞的高度。有多种方法可用，例如： 1．用胶布（透明胶，电工胶）在载玻片和盖玻片之间做一个“步距”。 2． 从胶布的中间剪出一块小的面积作为标本池，将标本放入中间的池中，盖上盖玻片封好。 ---------------------------------------------------------------------
问：我能固定 GFP 标记的标本吗？
答：GFP 的荧光会经脱水或者乙醇和丙酮固定而衰减，这些固定方法可能改变了 GFP 分子的性状。有研究报道，GFP 经甲醛固定后，荧光信号会大大减弱；标本长期放置在乙醇中会消弱 GFP 信号，并增强自发荧光。但是也有其他研究报道，用多聚甲醛（4% 缓冲液，固定 1 小时）可以成功地固定了转 GFP 的酵母细胞，荧光信号没有减弱。因此，你可以用低浓度的多聚甲醛，尽可能短时期地固定（对于细胞约 5~10 分钟）。标本可以放在甘油封片剂中（约含 90% 的甘油）。
注意：如果你的 GFP 是可溶性蛋白，会因为去垢剂的破膜丢失所有的信号。
据报道用指甲油封片可以导致 GFP 信号的丢失（因为指甲油中的乙酸乙酯/丙酮成分）。有报道以下方法可以用于封片：a) Almay Crème（hypo-allergenic，"Canyon" shade）; Wet 'n Wild's " Clear Nail Protector " 不含甲苯/甲醛（固定在苯二胺的甘油溶液中）; b) 融化的石蜡：简单的办法就是将石蜡加热融化用作封片剂。 使用活体组织和活细胞采集GFP信号， 可以获得最好的图像。 --------------------------------------------------------------------- 问：抗荧光淬灭剂的作用是什么？ 答：当荧光染料暴露在激发光下时，几乎都有漂白的现象（光漂白）。光漂白和以下因素有关：1）照射光的强度；2）照射光的照射时间； 3）其他影响荧光强度和荧光漂白的因素有pH、培养介质的性质，其他荧光淬灭的物质存在。
一种染料的光子产量代表染料被完全光漂白之前的激发周期的平均次数。平均光子产量是荧光量子效率（Qf）和漂白量子效率（Qb）的比。例如：荧光素对光很不稳定，在碱性溶液中 Qf /Qb 大约为 30K。Qf 和 Qb 都属于染料的性质，受染料环境的影响很大。主要影响 Qb 的因素是活性氧和自由基类物质。 一种抗荧光淬灭剂的主要目的是保持染料的荧光，使标本能用于更长时间的观察。抗荧光淬灭剂通常是通过抑制活性氧的产生和扩散来达到这一作用，因此降低了Qb，Qf并没有伴随着降低，荧光仍然保持不变。 --------------------------------------------------------------------- 问：推荐使用哪些抗荧光淬灭剂？ 答：一些常用的和最有效的抗荧光淬灭剂的优缺点比较如下，也提供了部分的商业来源以及共聚焦显微镜用户的意见和评价。 1．p-phenylenediamine (PPD)
尽管它是最有效的抗淬灭剂之一，但对光和热都有较强的敏感性，而且具有毒性，后者也限制了在体内研究的应用。Krenik 等（1989）建议最理想的 PPD 抗淬灭剂混合液配方是：90% 甘油、10% PBS，其中 PPD 的浓度在（2~7）mM 之间，最终pH值为 8.5~9.0。 2．n-propyl gallate (NPG)
NPG 无毒性，对光和热稳定，但抗漂白效果不如 PPD，可用于体内研究。推荐浓度在（3~9）mM，用甘油配置效果也不错。配置的方法在FAQ的后部分。 3． 1,4-diazobicyclo[2,2,2]-octane (DABCO)
DABCO是一种不电离的、稳定的抗淬灭剂，价格便宜而且容易使用。配置方法在 FAQ 的后部分。 4．Ascorbic acid (Vitamin C) 5．Vectashield
公司描述：具有在显微镜观察中阻止荧光的丢失并在长期储存过程中保持抗荧光淬灭的能力。抑制荧光素的漂白，例如：Texas Red , Rhodamine , AMCA 和其他的荧光染料。特别的是，比甘油缓冲液、聚乙烯醇固定液或者其他含有普通抗荧光淬灭剂的固定液更加稳定，光学清晰度更高。
Vector Laboratories, Inc.
30 Ingold Road,
Burlingame, CA 94010 USA
Tel： (415) 697-3600
Fax： (415) 697-0339
6．SlowFade
公司描述：SlowFade 的原始配方(S-2828)可将荧光素的荧光淬灭速率减小到零。尤其适用于激光扫描共聚焦显微镜的定量测定，因为其在测定时往往要求激发光强度较强，而且采集时间也较长。SlowFade 试剂可使荧光素的有效荧光发射扩大 50 倍以上，用该试剂封片后，细胞和组织中的荧光信号可保持两年之久。原始的 SlowFade 配方实际上可使荧光素的荧光完全淬灭，也可使 Cascade Blue 和 Alexa Fluor 350 荧光团的荧光几乎完全淬灭。
Molecular Probes, Inc.
P.O. Box 22010 Eugene, OR 97402-0414 USA
Tel： (503) 465-8300
FAX： (503) 344-6504
7．SlowFade Light
为了克服上述的局限，分子探针公司的研究人员又研制了 SlowFade Light 抗荧光淬灭试剂盒。该抗荧光淬灭剂的配方使荧光素的淬灭速率降低 5 倍，而荧光素的初始荧光强度没有显著降低，因此使光学显微镜的信噪比显著提高。此外，对 Cascade Blue, Alexa Fluor 350, tetramethylrhodamine 和 Texas Red 的淬灭也达到最小。实际上，SlowFade Light 抗荧光淬灭剂试剂盒可将 Cascade Blue 的淬灭速率几乎降到零，而其发射强度仅降低约 30%。 --------------------------------------------------------------------- 问：DABCO抗荧光淬灭封片剂的配方是什么？ 答：
DABCO 储藏液
1．在 60℃ 下，溶解 2 克 DABCO（抗荧光淬灭剂）于 90ml 甘油中，15-30 分钟。
2．加 10 ml 1M Tris-HCl，pH 7.5
3．用 5M HCl 调节 pH 值到 8.0
4．冷却到室温
5．加 100 ml 20% thimerosal（溶解于水）
6．可选：加 50 ml PI （储液：溶于水的 1 mg/ml PI ）
7．4℃ 于棕色瓶或箔纸包裹的瓶子中避光保存
缩写：
PI = propidium iodide
PI – 激发光与发射光与罗丹明相似 – 用 488 nm 或者 514 nm 的激发光 – 长通 570 nm 或者 600 nm 的发射滤片
DABCO = 1,4-二偶氮双环[2,2,2]-辛烷
Ordering (Sigma) ：
D2522 DABCO, 25g
T5125 thimerosal, 10g
P4170 PI, 10mg
--------------------------------------------------------------------- 问：N -丙基没食子酸盐（n-propyl gallate ，NPG）抗荧光淬灭封片剂的配方是什么？ 答：
溶于甘油的 5%N -丙基没食子酸盐
1．于 50 ml 试管中，加 5% N -丙基没食子酸盐到 25 ml 甘油中
2．摇晃混合过夜（室温或者 4℃）
3．使用之前静置一天，让溶液中的气泡跑掉
4．4℃ 于棕色瓶或箔纸包裹的瓶子中避光保存
--------------------------------------------------------------------- 问：采集的信号很弱，我该怎么办？ 答：决定图像质量的最重要的因素是标本质量。好的染色过程可以使图像具有强的信号和完全黑的背景。以下列举了部分的方法用来检测你的染色是否是最佳的： 厂商在他们的指南中经常会有“最佳稀释法”，你不能相信这个方法适合于所有的标本制备的方法。最好的办法是对一抗和二抗做一个梯度稀释，测定哪个稀释浓度处理的标本信号最好，背景最低。 尽量调整好阻断的步骤（改变阻断溶液的成分和洗脱时间）。如果样品要用甲醛固定，请确定不含游离的乙醛。有些调整是硬件方面的（光强或者检测的灵敏度），在信号很弱的标本上做硬件的调整，经常会导致背景很高。 |
